糞腸球菌（高耐）

糞腸球菌（高耐）復蘇步驟注意事項：

      【材料】
1.  常規細胞培養儀器設備 恒溫水浴振蕩器。
2.  培養液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）
【操作程序】
1.  細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射40min以上。
2.  培養液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min，備用。
3.  二甲基亞砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液*融化。
5.  將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。
6.  用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。
7.  記錄復蘇日期。
糞腸球菌（高耐） 常見問題及解決方案：
    細胞漂浮：培養瓶不開封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養箱。次日觀察，如細胞大部分又貼回瓶底，表明細胞活力正常，剩余漂浮的細胞可以離心去掉，留10ml培養液培養觀察，細胞生長至匯合度80%，進行消化傳代；如細胞還是不貼壁，將細胞離心收集轉到新培養瓶，原培養瓶加部分培養液繼續培養，中間注意觀察，我們的技術人員會一直跟蹤技術指導，直到問題解決。

   客戶收到細胞后請務必仔細閱讀細胞注意事項，確保細胞的培養條件*，如果由于培養條件不*導  致細胞出現問題，責任由客戶自行承擔。由于運輸的情況，所以個別細胞會出現不穩定，客戶收到細胞后務必*時間和我們，告知細胞具體情況，以便我們技術人員能及時有效的和老師溝通，不勝感謝！

【注意事項】
1.  取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
2.  凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是*無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內使凍存液*融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）選擇進口產品。
3.  離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。
4.  離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大， 死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇，結果無有異常。
5.  細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6.  復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。
7.  加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響 細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。

一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞zui易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。
二、操作步驟
（一）凍存
1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，不能揮發干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）復蘇
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。
3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。
6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第二天觀察生長情況。
三、     
試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等
試劑：0.25％胰酶、培養基、含保護劑的培養基（即凍存液）
附：凍存液配制：
培養基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。