乳鐵蛋白純化工藝介紹
乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是乳腺上皮所分泌的糖蛋白，是轉鐵蛋白家族中的一種非血紅素鐵結合蛋白，主要存在于乳汁中的乳清蛋白部分，母乳中的乳鐵蛋白含量約為2?3g/L，牛乳中的乳鐵蛋白含量約為0.8g/L。
乳鐵蛋白雖然含量較低，但有增強免疫力、抗菌作用、抗病毒活性、調節腸道菌群、促進鐵吸收、抗氧化作用、抗炎作用、促進生長發育、預防心血管疾病、改善口腔健康等功效，在人體的健康維護和生理調節過程中發揮著關鍵作用，對嬰幼兒的生長發育以及成年人的健康都有著重要意義。
乳鐵蛋白是一條700個氨基酸組成的糖基化修飾的肽鏈，折疊后形成兩個同源的球狀域，即N-環和C-環。這兩個域由一段短的α-螺旋連接，每個域進一步分為兩個子域（亞域），即N1、N2和C1、C2，每個域包含一個鐵結合位點和一個糖基化位點。分子量約為80 kDa。因結合鐵離子，純化后的乳鐵蛋白呈紅色。乳鐵蛋白的三維結構呈現出一種典型的球狀結構，直徑約為10 nm。其表面帶有正電荷，這有助于與陰離子生物化合物結合。
乳鐵蛋白具有多種重要功能，已被中國、美國作為食品營養強化劑用于運動和功能性食品。部分產品已被歐洲藥品管理局(EMEA) 與美國食品藥品管理局(FDA) 評證為孤兒藥品。
資料顯示，荷蘭DMV公司，為較大的乳鐵蛋白供應商，歐洲絕大部分奶粉所采用的乳鐵蛋白即由其供應。其生產的乳鐵蛋白純度高達97%，是通過美國FDA的GRAS認證（認可安全使用物質）的乳鐵蛋白原料。
乳鐵蛋白含量較低，需經過大量預處理步驟，制備得到粗品，再進行精細純化。
文獻[1]，利用牛初乳作為起始物料，經過離心脫脂、凝乳酶酶解、離心分離酪蛋白沉淀；離心母液為乳清蛋白液，經超濾分級，按照＞200KD（酪蛋白），＞100KD（球蛋白），＞50KD（乳鐵蛋白粗品），＞10KD（乳白蛋白）分段，制備得到50KD~100KD的乳鐵蛋白粗品，再經陽離子交換樹脂純化，脫鹽濃縮、-35℃~-41℃真空度47Pa冷凍干燥，得到高純度的的乳鐵蛋白粉。
文獻[2]，利用牛奶做起始物料，采用硫酸銨分級沉淀除酪蛋白、免疫球蛋白，最終離心上清調pH8.5，采用80%硫酸銨沉淀制得乳鐵蛋白沉淀粗品，再通過Sephadex G-100，制備得到純度為92%的乳鐵蛋白，收異構體和鐵離子結合狀態的影響，乳鐵蛋白有不同分子量表現形式，純化后的乳鐵蛋白在475nm有最大吸收峰。
文獻[3]，重組枯草芽孢桿菌產乳鐵蛋白 N 葉，經誘導培養、菌體收集、破菌、離心、親和層析、超濾濃縮、凝膠層析等多步純化，1g菌體能制備得到23.5mg純蛋白。
文獻[4]匯總乳鐵蛋白分離純化方法比較如下：
分離方法 | 優點 | 缺點 | 應用范圍 |
離子交換色譜法 | 操作簡單、可持續進樣 | 產量低、產品純度低、成本高 | 實驗室等小規模 |
鹽析法 | 成本低、操作簡單 | 產量低、產品純度低 | 工業生產低純度的乳鐵蛋白 |
超濾法 | 操作簡便、費用低 | 產品純度低、易堵塞膜孔 | 工業生產 |
親和色譜法 | 操作簡單、分離效果好、產品純度較高、產品無生物活性損失 | 成本高、不適合商業化生產 | 實驗室等小規模 |
離子交換色譜法結合超濾法 | 產品純度較高、分離效果較好 | 操作步驟復雜,成本較高 | 實驗室等小規模 |
鹽析法結合凝膠層析法 | 產品純度較高 | 操作步驟復雜 | 實驗室等小規模 |
模擬移動床色譜 | 成本低、分離效果好連續操作、處理量大 | 速度慢、不易控制 | 工業生產 |
上述方法各有優缺點。
超濾法主要利用蛋白的分子量大小差異進行分級分離，膜過濾處理量大、自動化程度高，但所得產品純度低，易堵膜孔，只要解決膜過濾堵塞問題，仍為大規模制備乳鐵蛋白粗品的好方法。
離子交換法雖然操作相對復雜，但利用乳鐵蛋白和其他蛋白的性質差異，制備高純度乳鐵蛋白。
親和色譜法具有較高的選擇性，可從粗品蛋白直接提純目標蛋白純度，但親和層析材料價格較貴，還未能用于大宗產品的制備生產。
應用超濾法結合離子交換樹脂法，通過料液預處理、超濾分級方法，可提高離子交換樹脂效率。
博納科技致力于膜應用工藝的開發，在天然提取蛋白、發酵來源蛋白的澄清過濾、分級、脫鹽、濃縮方面，接觸和解決了大量物料過濾難題，積累的豐富的工藝和工程經驗。牛奶制品產業產品豐富，生產工藝多樣，如酪蛋白濃縮、乳清蛋白回收、乳清蛋白脫糖脫鹽、乳清蛋白分級等，應用了大量膜過濾工藝。隨著產品類型的細分，在物料預處理、膜選型、膜過濾參數優化等方面，仍值得繼續探索與提高。
參考文獻：
1]馬闖,蘇政波,李瑞國,等.從牛初乳中提取酪蛋白、免疫球蛋白、乳白蛋白、乳鐵蛋白生產工藝的研究[J].山東食品發酵, 2004(4):2.
[2]曲練達等. "乳鐵蛋白的分離純化." 中國畜牧獸醫學會家畜傳染病學分會第六屆理事會第二次會議暨教學專業委員會第六屆代表大會論文集 2006.
[3]金亮,李利宏,張榮珍,等.重組枯草芽孢桿菌發酵生產乳鐵蛋白N葉工藝優化[J].生物工程學報, 2022, 38(7):2628-2638.
[4]王雨奇,孫翠翠,杜鵬.乳鐵蛋白分離純化及功能特性的研究進展[J].乳品與人類, 2023(2):44-52.
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