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HPLC-MS 法測定血漿中克林霉素的濃度

2012-11-8　

摘要:目的　建立快速測定人體血漿中克林霉素濃度的液相色譜2質譜測定法。方法　血漿樣品以甲醇沉淀蛋白,

直接將上清液酸化后進行HPLC-MS 分析,色譜柱為Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm ,5μm） ;流動相為40 mmol·L - 1乙酸銨緩

沖液（pH 4.1）-甲醇（30∶70 ,V/ V） ;內標為林可霉素;檢測離子（ m/ z） :425.2 （克林霉素[M + H] + ）、407.3 （內標林可霉素[M +H] + ）。

結果　血漿標準曲線線性范圍為0.01007 mg·L - 1～10.07 mg·L - 1 ,高、中、低3 種濃度的批內和批間精密度均小于1010

% ,提取回收率為87.0 %～92.4 %。20 名健康受試者隨機交叉口服受試制劑和參比制劑各300 mg 后,用HPLC2MS 法測定血漿

中克林霉素血藥濃度,用面積法估算的受試制劑的相對生物利用度為（10013 ±1015） %。

結論　建立的HPLC2MS 分析方法快

速、靈敏、準確、簡便,適用于臨床藥代動力學研究。

關鍵詞:克林霉素;液相色譜2質譜;藥代動力學

中圖分類號　R927. 1 　　文獻標識碼　A 　　文章編號　10072306 （2006） 032159203

Rapid Determination of Clindamycin in Human Plasma by HPLC2MS

ZHANG Hong2xi1 ,LI Chun2ying2 ,Chen Guo2wei2 ,Ding Li2

1 Hunan Jianlang Pharmaceutical Industry Co1 , Ltd 　（ Yueyang 　414000）

2 China Pharmaceutical University 　（ Nanjing 　210009）

　　ABSTRACT:AIM　To develop an HPLC2ESI2MS assay for the determination of clindamycin in human plasma. METHODS 　After be2

ing deproteinated by methanol ,plasma samples were separated by HPLC2MS on a reversed2phase C18 column with a phase of 40 mmol·

L - 1 ammonium acetate buffer solution （pH 411）2methanol （30∶70 ,V/ V） ,in which the target ions （ m/ z） were at 42512 for clindamycin and

40713 for the internal standard. RESULTS 　A good linearity was obtained from 0101 mg·L - 1～10107 mg·L - 1 of clindamycin with r =

019999. The RSD of within2day and between2day variation of the method were both less than 10 %. The recoveries of four concentration

0101007 ,011007 ,11007 ,10107 mg·L - 1 were 8710 %～9214 %. The randomized crossover trial was performed in 20 healthy volunteers using

the test capsules and reference capsules individually at a single 300 mg dose. Then blood samplings from the subjects were conducted for

HPLC2MS analysis and the relative bioavalability of the test capsules was （10013 ±1015） %. CONCLUSION　The assay was proved to be

rapid ,sensitive ,accurate and convenient. It can be used to study pharmacokinetics of clindamycin.

KEY WORDS :Clindamycin ;HPLC2ESI2MS;Pharmacokinetics

　　克林霉素（Clindamycin）是林可霉素的衍生物,抗菌作用較林可霉素強,用于金葡菌、厭氧菌引起的

嚴重感染。本實驗建立了快速測定人體血漿中克林霉素濃度的液相色譜2質譜聯用測定法。并將該法用于監測健康志愿者口服克林霉素受試制劑和參比制劑的血藥濃度經時過程,估算受試制劑的相對生物利用度,同時為臨床用藥提供參考。

1 　儀器與試藥

1. 1 　儀　器

Agilent 1100 液相色譜2質譜聯用儀（美國Agilent公司）。

1. 2 　試藥與試劑

克林霉素標準品（中國藥品生物制品檢定所,含·159 ·

江蘇藥學與臨床研究　　2006 年第14 卷第3 期

X [通訊作者] 　 :025283271289

量:8712 %） ;林可霉素標準品（內標,中國藥品生物制品檢定所,純度:8514 %） ;鹽酸克林霉素膠囊（受試制劑, 江蘇亞邦愛普森藥業有限公司, 批號:030608 ,規格:150 mg/ 粒） ;鹽酸克林霉素膠囊（參比制劑,常州蘭陵制藥有限公司,批號:030620 ,規格:150 mg/ 粒）。甲醇（色譜純,Merck 公司） ;乙酸銨為分析純;水為去離子純凈水。

2 　實驗方法

211 　色譜與質譜條件

色譜柱:Lichrospher C18柱（250 mm ×416 mm ,5μm ,江蘇淮陰漢邦科技有限公司） ;流相:40mmol·L - 1乙酸銨緩沖液（pH 411）2甲醇（30∶70 ,V/ V） ; 柱溫:25 ℃;進樣體積:40μl ;離子極性:正離子;離子

化方式:氣動輔助電噴霧離子化;離子檢測方式:選擇性離子檢測（SIM） ;檢測離子（ m/ z） :42512 （克林

霉素[M+ H] + ）、40713 （內標,林可霉素[M + H] + ） ;傳輸區電壓:110 V ;干燥氣流量:10 L·min - 1 ;霧化室壓力:276 kPa ;干燥氣溫度:350 ℃。212 　標準溶液的配制克林霉素標準溶液的配制:精密稱取克林霉素10107 mg ,置10 ml 量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得11007 g·L - 1克林霉素的儲備液。取儲備液1 ml 置10 ml 量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得10017 mg·L - 1克林霉素甲醇溶液;再依次稀釋,定容配成10107 、11007、011007 mg·L - 1的克林霉素甲醇標準溶液。內標（林可霉素）標準溶液的配制:首先精密稱取內標10136 mg ,置10 ml 量瓶中,加入甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得11036 g·L - 1內標儲備液。取儲備液0120 ml 置50 ml 量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得41144 mg·L - 1的內標甲醇溶液。213 　血漿樣品處理精密吸取血漿樣品012 ml ,置1 ml 離心管中,加41144 mg·L - 1內標溶液50μl ,渦旋10 s ,再加入甲醇017 ml ,渦旋3 min ,16000 r·min - 1離心5 min ,吸取

上清液015 ml 轉移至另一1 ml 離心管中,加入100mmol·L - 1的乙酸銨緩沖液（pH 411） 70μl ,渦旋10 s

混勻,于16000 r·min - 1離心3 min ,吸取上清液,轉移至自動進樣器樣品管中,進行LC2MS 分析,進樣體

積40μl 。

214 　試驗方案

20 名男性健康受試者,體重59～66 kg ,身高164

～174 cm ,按體重指數BMI 為2119 ±011 ;年齡22～

32 歲。經體檢證明肝、腎功能正常,心電圖正常。

采用標準二階段交叉設計自身對照試驗法,按自身

交叉對照試驗方案將受試者隨機分為T、R 兩組。

試驗*階段T 組口服受試品鹽酸克林霉素膠囊

300mg ,R 組口服參比品鹽酸克林霉素膠囊300 mg。

實驗前2 周及實驗期間未服用其它任何藥物;實驗

期間統一飲食。受試者于服藥前及服藥后10 、20 、

30 、45 min ,1、115、2、3、5、8、11 、14 h 采血3 ml 于肝素

化試管中,分離出血漿,于- 20 ℃保存待測。經1

周清洗期后,T、R 兩組交換服藥順序進行第二階段

試驗。

3 　結　果

311 　色譜行為

在本實驗條件下,克林霉素保留時間為518 min

左右;內標保留時間為315 min ,并無雜峰干擾測定,

見圖1。

圖1 　不同樣品的色譜圖

A:空白血漿;B :加入克林霉素和內標標準品后的血漿;C:健康受試者口服鹽酸克林霉素膠囊后的血漿（加內標）312 　標準曲線的制備取離心管數支,分別精密加入不同量的克林霉·160 ·

江蘇藥學與臨床研究　　2006 年第14 卷第3 期

素標準液后以氮氣流吹干,加入空白血漿012 ml ,渦

旋1 min ,配成含克林霉素分別為0101007、0103021、

011007、013021、11007、21014、51035、10107 mg·L- 1的

標準血漿,按“213”項下測定,記錄色譜圖,計算克林

霉素峰面積As 和內標峰面積Ai 的比值f （ f = As/

Ai） ,以f 值對血藥濃度（ C） 作權重回歸計算, 得回

歸方程:

f = 019069 ×C + 41838 ×10 - 4 （權重系數1/ C , r

= 019992）。

按上述條件測得克林霉素在血漿中的zui低定量

限為0101007 mg·L - 1 （S/ N≈10）。

313 　精密度試驗

取離心管數支,按“312”項下制備含克林霉素濃

度分別為0101007、011007、11007、10107 mg·L - 1的含

藥血漿（每個濃度做5 份樣品）及一條隨行標準曲

線,同“213”項下測定。每天做一批及一條隨行標準

曲線,連續做3 天,共3 批,每批每個濃度做5 份樣

品,以此計算批內和批間精密度。含克林霉素分別

為0101007、011007、11007、10107 mg·L - 14 種濃度的

批內精密度分別為:4159 %、2176 %、2134 %、1103 %;

其批間精密度分別為: 6110 %、4162 %、3142 %、

2109 %。

314 　提取回收率測定

考察了含克林霉素為0101007、011007、11007、10107 mg·L - 1 4 種濃度的標準血漿提取回收率,結

果分別為87101 % ±4156 %、87152 % ±3197 %、91161 % ±2173 %、92144 % ±1144 %（ n = 5）。315 　準確度試驗（方法回收率）考察了含克林霉素為0101007、011007、11007、10107 mg·L -1 4 種濃度的標準血漿方法回收率,結果分別為10513 % ±5150 %、92174 % ±2160 %、98194 % ±2124 %、10011 % ±0157 %（ n = 5）。316 　穩定性試驗在0101007、011007、11007、10107 mg·L - 1 4 種濃度水平考察含克林霉素標準血漿的穩定性,結果顯示克林霉素血漿分別在室溫放置8 h、反復凍融、-20 ℃冰箱中冷凍保存3 周的條件下均穩定。317 　藥動學研究本實驗采用中國藥科大學藥代中心楊勁編寫的Bapp210 軟件,估算藥代動力學參數以及進行生物等效性的評價,對兩種制劑的參數AUC02τ、Cmax進行自然對數轉換后先用雙交叉實驗設計的方差分析,再用雙向單側t 檢驗進行生物等效性評價; 參數tmax采用非參數法（Wilcoxon 符號秩檢驗）進行統計。20 名健康受試者分別口服參比和受試兩種制劑各300 mg ,用HPLC2MS 法測定血漿中克林霉素濃度,用面積法估算受試制劑的相對生物利用度為（10013 ±1015） %。其平均血藥濃度2時間曲線見圖2。

圖2 　20 名受試者分別口服參比和受試兩制劑300 mg 后的克林霉素的平均血藥濃度2時間曲線

—● —參比; —□ —受試

20 名健康受試者口服受試制劑估算的克林霉素的AUC0214為17102 ±3193μ__________g·h - 1·ml - 1 ,消除半衰期為217 ±015 h ,達峰時間和達峰濃度分別為017 ±012 h 和4158 ±1110 mg·L - 1 ;口服參比制劑估算的克林霉素的AUC0214為17122 ±4176μg·h - 1·ml - 1 ,消除半衰期為218 ±016 h ,達峰時間和達峰濃度分別為018 ±013 h 和4169 ±1119 mg·L - 1 ,兩種鹽酸克林霉素膠囊制劑的藥代動力學參數相近。

4 　討　論

在血漿樣品的處理過程中,文獻[1 ]采用有機溶劑提取法提取血漿中的克林霉素;文獻[2 ]采用固相萃取小柱萃取法提取血漿中的克林霉素,操作繁瑣費時。本實驗采用甲醇直接沉淀血漿中的蛋白,所需血漿樣品量小,經渦旋和離心后取上清液酸化進行HPLC2MS 分析測定,前處理過程操作簡便,在處理大批量血漿樣品時可大大減少工作量和節省時間。此外,實驗中發現,若血漿樣品經甲醇沉淀蛋白后直接進HPLC2MS 分析,則克林霉素和內標峰形均不佳且響應較低。在上清液中加入乙酸銨緩沖溶液后,克林霉素和內標峰形尖銳且響應增大。本方法簡便、快速、準確,可用于克林霉素的血藥濃度測定和臨床藥代動力學研究。

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